居然有了30人的科研團隊（雖然能打的不多）算了一下，現在居然有了一個30人的科研團隊（雖然能打的不多）。遙想自己當年孑然一身來蘇州，今天至少不是科研光棍了，聊以自慰（雖然還是沒有拿的出手的科研成績，而且責任遠多于實惠）。趁實驗室規模還沒萎縮，趕緊記錄一下今天的團隊。 能打的：7個· 1個剛完成博士答辯的博士：實力很強，可惜馬上就要離開我們了。· 3個生物科學系的在讀博士：非常優秀，這3個是主力。· 1個和數學系合招的在讀博士：主要在做我這邊的項目，非常優秀，也是主力。· 2個等著入學的準博士生：兩個學生都非常有潛力。 服務員：2個· 1個PI：我自己，脫離科研一線已經很久了，基本上看不懂超過10行的代碼。生物信息學這個領域日新月異，很多新工具都不會用，甚至連名字都不記得。· 1個科研助理老師：其實是和日本人團隊共有的，但是在我這邊的時間可能更多一些。學校居然能給普通老師科研團隊配備半個科研助理，也算是很贊的事了。這位老師很快要有小寶寶了，祝寶寶順利。 打醬油的：4個· 1個和數學系合招的博士生：牛津統計碩士，硬實力很強，但主要做另外那位合作老師的項目，在我這邊只負責出出主意。· 1個兼職博士生：實驗轉到生信，現學編程，2個小娃的媽媽，兼職讀博。你敢不敢有期待？希望她能做多少算多少吧，保證幸福的畢業就好。· 2個碩士生：兩個學生都是實驗轉到生信，現學的編程。學校碩士培養政策按英國體制走，一共1年半時間，

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半年上課，科研項目和碩士論文撰寫時間一共只有一年。你敢不敢有期待？希望他們能做多少算多少吧，保證幸福的畢業就好。 本科畢業設計學生：9個· 4個生物信息專業學生；· 3個和數學系老師合帶的數學系學生；· 2個從離職同事手裡轉過來的學生；(說實話，這些本科生都非常優秀，完全可以做出不錯的科研工作。可惜學生課多，又忙著申請研究生項目，還要考託福GRE等英語成績，科研項目基本處于停滯狀態。根據以往的經歷，四年級學生一般要等過年後拿到美國offer才能正式全力開工幹科研的活。) 過家家的：8個· 已經畢業的本科生2人：本科畢業生，gap一年，等研究生項目的錄取。· 在讀的本科生6人： 二三年級本科生，做點小東西，由師兄師姐們帶著過家家。大家開心就好。要什麼自行車？提示：愛好生物學的可從第一段讀起，愛好“青稞”（青科）靚照和辛酸故事的請直奔最後部分。如果你看多了那些神人神操作的故事，或許在我們普通人之間對于科研和職業精神的樸實理解更有惺惺相惜的感覺。 地球上最冷的區域當數南極大陸。那裡最低氣溫可達到-89.2oC，

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約有99.8%的面積被平均2公裡厚的冰層覆蓋（圖1）。雖然如此，

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在沒有冰蓋的區域地表溫度常年在-35oC ~ 5oC範圍內波動。南極的動植物生活在有季節性融水的無冰蓋區域，而微藻和其他微生物則不僅生活于這些區域，還能生活于雪地、海冰和封存于冰蓋之下的湖泊之中。南極與其他大陸的動植物群落相互隔絕，但是其他大陸的微生物卻可以通過大氣層流等途徑達到南極。 圖1. 南極正面觀。一些山脊（右上角圖）和海岸帶（右下角）有裸露的陸地（網絡下載圖片） 南極為何如此寒冷？在地質史上，南極是從岡瓦納大陸分離出來的。約在3400萬年到3300萬年前，CO2濃度和氣溫驟降，冰層覆蓋南極。約2300萬年前，南極洲與南美洲完全斷開，成為孤立的大陸，環南極洋流隔斷了南極與外界的熱量交換。較少的太陽輻射、冰層的反射加上洋流的隔溫作用，導致南極成為地球上最為寒冷的區域。隨大陸漂移帶去南極的嗜溫微生物在經歷地質史上迅速冷卻的時期後可能成為嗜冷微生物；另一方面，後來被大氣層流轉移到南極的微生物也可能演化出抗凍能力和在低溫下生長的能力。生活在無冰蓋地區的南極微生物需要在冰凍時期保持存活力，在0oC左右溫度時保持細胞活性和生長能力。抗凍能力主要依靠冰晶結合蛋白和LEA蛋白（最早發現于植物胚胎發育晚期，稱為Late Embryogenesis Abundant protein，後發現于其他各類生物）的作用；有關細胞如何在低溫下保持生化反應速率，目前認為主要是基于冷適應□或嗜冷□的作用。與同源的嗜溫□相比較，嗜冷□積累了一些突變，導致蛋白整體結構或活性位點週圍結構柔性增加、催化反應最適溫度降低（圖2）。但是，積累這類突變需要較長的時期，細胞在低溫下的生長又需要許多□都獲得冷適應。因此，在□獲得冷適應之前，細胞如何盡快獲得生長能力，成為溫帶微生物適應南極環境的關鍵環節，也是一個尚未解答的重要問題。 圖2. 嗜冷□(藍色)與同源的嗜溫□(紅色)溫度適應性的差異 大約20年前，本實驗室從南極中山站附近一處季節性積水的石塊上分離到小球藻（Chlorella vulgaris）NJ-7（圖3），其18S rRNA-ITS1-5.8S rRNA序列與從北溫帶分離到的小球藻UTEX259完全一樣，ITS2和28S rRNA也僅各有2~3 bp的差異，應為同一種。兩個藻株在20oC時生長幾乎沒有差異，但在4oC時只有NJ-7能夠生長；NJ-7比UTEX259在-20oC的抗凍力也有大幅提高（圖4）。光合作用的溫度適應性進一步顯示NJ-7實際上是一個嗜溫藻株，只是已發展出在低溫下的生長能力 圖3. 小球藻南極株顯微照片和在冰箱中生長的情形圖4. 小球藻南極株NJ-7和溫帶株UTEX259抗凍力（小柱形圖）和低溫生長能力的差異。 (a) 在20oC條件下生長；(b) 在4oC條件下生長（參考文獻1） 為了分析小球藻適應南極的機理，我們對兩個藻株進行了全基因組序列分析。核基因組共線性分析，以及葉綠體、線粒體基因組結構都支持二者為同一物種。它們的葉綠體基因組基因組成相同，除兩處顛倒外基因排列十分一致；線粒體基因組的基因組成和排列均一致。由于非編碼區的差異，南極株兩種細胞器基因組均小于溫帶株。以36個共同的葉綠體基因構建以植物化石作年代標記的綠藻演化系統關系樹（圖5），推算出小球藻NJ-7和UTEX259的分離時間約在260萬年（95%置信限110 ~ 440萬年）前，

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遠遠晚于南極洲與南美洲分離的時間。因此，小球藻南極株應該是自溫帶轉運過去的。圖5. 以植物化石為年代標記的綠藻系統關系樹（參考文獻1） 小球藻的抗凍能力與其LEA蛋白的豐度密切相關。本實驗室曾發現小球藻的兩種新型LEA蛋白，稱為Ccor1和Ccor2。表達純化這兩種蛋白，各自加至乳酸脫氫□溶液，可防止凍融對□活性的破壞（圖6）。在獲得全基因組信息後，我們進一步開展了LEA蛋白基因的系統挖掘，在NJ-7和UTEX259分別發現了23個和22個LEA蛋白基因，其中一些在染色體上串聯排列，有的單獨存在（圖7a）。一些在染色體上串聯的基因在系統關系樹上成簇分布（圖7b），提示這種基因叢可能是通過基因加倍的方式形成的。預測顯示，這些LEA蛋白分布于小球藻細胞的核和細胞器、胞漿、質膜等部位，負責在冰凍條件下保護不同部位的□免受破壞（圖7a）。 圖6. 小球藻LEA蛋白Ccor1和Ccor2在凍融條件下對乳酸脫氫□的保護作用。加不同濃度Ccor1錛 Ccor2或其他 對照至乳酸脫氫□（LDH）溶液，經凍融處理之後殘留的LDH活性（參考文獻2） 圖7. 小球藻LEA蛋白基因在染色體上的分布（a）和系統關系（b）。（b）中還預測了LEA蛋白在細胞內的分布（參考文獻1） 轉錄組和定量蛋白組學分析表明，無論在20oC還是4oC條件下，NJ-7中都有若幹LEA蛋白顯著高于UTEX259中相應蛋白的水平（圖8）。這些LEA蛋白的積累是與小球藻南極株抗凍力的顯著提高相一致的。 圖8. 在轉錄組和蛋白組數據中NJ-7和UTEX259的LEA蛋白的差異表達。星號指示mRNA水平的顯著差異。hiC6不同 拷貝在蛋白和mRNA水平難以區分，Ccor1和Ccor2在蛋白水平難以區分，故合並統計（參考文獻1） 那麼，小球藻南極株如何在4oC條件下維持細胞活性、獲得生長能力呢？首先以硝酸還原□為例進行研究（圖9）。比較NJ-7和UTEX259的硝酸還原□，發現最適溫度沒有顯著偏移，是典型的嗜溫□，但NJ-7的硝酸還原□活性（比活性不變）顯著高于UTEX259，可能是由硝酸還原□的含量造成的。Western blot分析證明NJ-7中的硝酸還原□含量確實顯著高于UTEX259，與□活性差異相吻合。定量蛋白組分析顯示出硝酸還原□和亞硝酸還原□都在NJ-7中顯著增加。這兩種□在蛋白水平的增加使得小球藻可在4oC利用硝酸鹽。 圖9. 硝酸還原□和亞硝酸還原□在NJ-7和UTEX259的差異表達。（a）NJ-7和UTEX259的硝酸還原□、亞硝酸還原□中存在的 少量置換突變（紅點）；（b）NJ-7和UTEX259中硝酸還原□豐度和溫度適應性的比較;（c）硝酸還原□和亞硝酸還原□基因 在轉錄組和蛋白組數據中顯示的差異表達。定量蛋白組學方法對蛋白含量差異存在低估，1.3倍約相當于Western blot顯示出的 2倍以上差異（參考文獻1） 定量蛋白組學分析還顯示，許多與碳代謝相關的□，譬如一些參與多糖、寡糖的水解和再利用的□，參與糖酵解途徑的□，在NJ-7中的水平都顯著高于UTEX259（圖10）。在生化反應途徑中，限速步驟的□對于反應途徑的總體速率起關鍵作用，這些□顯著增多就可能使生化反應在4oC保持活躍。在NJ-7中，有400餘種□/蛋白的水平都顯著高于UTEX259，這些□/蛋白含量的增加使NJ-7在低溫下得以維持生命活動，促進其生長。圖10. 參與碳代謝的部分□在NJ-7和UTEX259中差異表達的情況。橘黃色框表示在NJ-7中比在UTEX259中含量顯著增加的□（參考文獻1） 生物對于寒冷的適應有兩個不同的概念：一個是cold acclimation，是指將生物體從適宜溫度轉移到低溫下引起的生理生化響應，是以基因表達調控為基礎的；另一個是cold adaptation，是指生物歷經多代處于低溫環境導致適應性演化，是以積累遺傳突變為基礎的。蛋白組和轉錄組數據比較顯示，cold acclimation引起小球藻許多基因的差異表達，大多數在蛋白和mRNA水平相一致，而兩個藻株之間的差異（包括cold adaptation、其他適應和遺傳漂變，但cold adaptation可能起主要作用）在蛋白和mRNA水平大多不一致，顯示在NJ-7演化過程中□/蛋白含量的增加主要是在翻譯或翻譯後水平引起的（圖11）。在蛋白水平比較cold acclimation引起的NJ-7表達差異與藻株之間在4oC的表達差異，發現重疊很少（圖12）。絕大多數在NJ-7細胞中含量提高的□/蛋白都是不受低溫誘導表達的。這是由于響應cold acclimation的調控表達主要是緩解低溫生理脅迫，不是形成在4oC的生長能力，而小球藻的種內演化導致NJ-7獲得在4oC的生長能力，兩者所涉及的基因範圍差別較大。 圖11. 轉錄組與蛋白組數據之間以及蛋白組數據之間上調表達基因的重疊關系。（a）藻株在4oC和20oC條件下的差異表達；（b）在4oC或20oC條件下兩藻株之間的差異表達；（c）定量蛋白組分析顯示的基因差異表達重疊關系。Prot.，蛋白組數據；RNA，轉錄組（RNA-seq）數據（參考文獻1） 圖12. 對cold acclimation與cold adaptation關系的圖示。圖中數字為NJ-7在4oC比在20oC時表達水平顯著上調的蛋白數（綠色） 和在4oC 條件下NJ-7比UTEX259含量顯著增加的蛋白數（棕色）。表達下調與含量減少的蛋白之間的重疊關系與此類似 除了蛋白水平的差異以外，NJ-7相對于UTEX259也有一些□存在正向選擇，

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這種正向選擇最終可能導致嗜冷□的形成。譬如，植物細胞膜的外半層富含鞘脂，鞘脂脫飽和□的表達與植物抗寒能力相關。小球藻NJ-7的鞘脂脫飽和□不僅受低溫誘導表達、在NJ-7比UTEX259水平更高，而且還存在正向選擇，是三項特征疊加的少數□之一。基于對小球藻在南極環境下早期適應演化的研究，我們認為微藻和其他微生物對于常年寒冷環境的適應可分為兩個過程：一是通過較少的突變盡快使得生化反應途徑的關鍵□獲得積累以提高在低溫下的生長能力，

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同時積累LEA蛋白或者冰晶結合蛋白以提高抗凍能力，獲得“生存權”、確定“居民身份”；二是進一步積累冷適應突變，使嗜溫□逐步成為嗜冷□，提高在低溫下□的比活性，以降低蛋白豐度、減少能量消耗，成為嗜冷物種。第一個過程快，第二個過程慢，雖非截然分開，但在時間上形成兩個步驟。這一“兩步適應模式”初步解釋了溫帶微生物到達南極等常年低溫環境後的早期適應機制。此外，NJ-7和UTEX259是罕見的以百萬年計的種內演化例證，本研究也可作為微生物轉運到南極後適應性演化的第一個實例研究。科學部分講完了，那“青稞”故事呢？當然有啊，先上靚照：“青稞”王雅麗 王雅麗與孩子 她叫王雅麗，博士畢業當了8年的助理研究員，從讀博至今差不多14年時間，這輩子最美好的時光除了獻給親人，就是獻給了小球藻，現在還是一個小姑娘的媽媽（看照片，有沒有感受到基因的強大？）。 高宏在南極 高宏（右二）在球場 他叫高宏，這輩子最美好的時光獻給了親人和科研，還有籃球和乒乓球，是一個男孩的爸爸，還是黨支部書記□。他就是20年前去南極採集藻類的人，在這項研究中還參加了小球藻的生理學研究。以下的內容就不說他啦，讓上面那個小姑娘的媽媽代表青稞們吧。王雅麗就是參考文獻1的第一作者，她完成了絕大部分生物信息學分析和小部分實驗分析工作。十幾年前，我們只能通過差減雜交、構建cosmid文庫、基因克隆、表達分析等等常規方法做一些分子遺傳學研究。8年前，王雅麗就是用小球藻做這樣的研究獲得博士學位。那時候，測基因組已經是一件時髦的事情，我們要更清楚地理解小球藻怎樣適應南極環境，大概只有去基因組裡找線索了。王雅麗留在研究所當助理研究員，從學習計算機語言和基因組學分析方法做起，繼續開展小球藻適應南極的研究。本來猜想，是不是小球藻通過橫向轉移途徑獲得了什麼嗜冷菌的基因從而適應南極，可是找到了許多橫向轉移的基因，卻沒有發現這些基因跟嗜冷有什麼關系，多數基因甚至沒有明確功能，沒法解釋諸多代謝途徑為何能夠在低溫下維持較高活性。如果說根據已有的信息把LEA基因挖掘出來，把兩個藻株之間差異之處擺一擺，把小球藻與其他綠藻的相似之處羅列一番，並非不能發表，當時一些不錯的刊物也有這類文章，但是對于我們最關心的問題好像就是搔了一下癢，並沒有找到答案。後來，測RNA-seq的技術服務普及了，于是滿懷希望地去全基因組的差異表達裡找答案。結果發現，不同溫度間差異表達涉及的基因有2000個左右，兩個藻株間的差異表達基因有900多個，同一個代謝途徑往往在兩個藻株之間各有基因上調表達，仍然不能幫助我們理解小球藻在低溫下的生長能力，唯有LEA蛋白基因的差異表達與藻株的抗凍能力相吻合。而且，mRNA水平的差異表達並不意味著蛋白水平的差異。這期間，像許多青稞一樣，王雅麗也寫過基金申請，希望通過實驗手段對她挖掘到的20多個LEA蛋白作細胞定位，並分析功能，得到專家的評審意見卻是“意義不大”，沒有批準。可是，之後國外有實驗室在Plant Cell發表了對擬南芥LEA蛋白定位的系統研究。不知專家們後來有沒有注意到在Plant Cell發表的這篇論文與他們否定掉的一個青稞的想法是不謀而合的？沒有論文發表對于青稞更是莫大的煎熬。實驗室也安排王雅麗參加了其他一些項目，總算能有論文發表，但是離競聘副研究員的要求差距還比較大。基因組和轉錄組分析都不能提供足夠的信息回答小球藻如何在南極獲得繁殖能力的問題，

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這似乎困住了我們。但是，當我們回顧組學分析之前做過的研究卻獲得了一絲啟發。王雅麗的師姐劉小香（參考文獻1的第二作者）曾專門分析過小球藻兩個藻株硝酸還原□的溫度適應性和表達差異。她發現，藻株之間硝酸還原□氨基酸序列和溫度適應性差異很小，但是南極株的硝酸還原□含量要高很多，導致在低溫下的□活性顯著提高（比活性不變）。這提示某些關鍵反應的□通過蛋白水平的提升維持在低溫下的□活性。要回答這一適應策略是否具有普遍性，需要對兩個藻株進行定量蛋白組學分析。終于，定量蛋白組學的技術服務也普及化了，我們可以分析不同溫度和藻株之間在蛋白水平的差異表達了。等到數據出來，才發現只有同一藻株在不同溫度下的差異可以分析，而不同藻株之間不可以，原因是蛋白序列存在個位數到兩位數的氨基酸殘基的差異（畢竟已分離260萬年之久），軟件不能識別為同一蛋白。最後，直到想出把蛋白質切成□段、提取出相同□段重新建庫的方法才克服了這一困難，實現了兩個藻株之間蛋白水平差異表達的組學分析。蛋白組學的分析果然證明了我們的猜想，許多關鍵的□在南極株中的含量顯著地增加了。等到我們完成全部分析，撰寫和修改完論文稿，離王雅麗8年“非升即離”的期限已經只有8個月的時間了。一個青稞面臨“非升即離”的威脅，沒有焦慮那是不可能的。王雅麗度過了許多焦慮的日子，但幸運的是，她背後有3位“合作導師”的幫助，論文經過兩輪修改終于被接受發表，較為完整地講述了小球藻怎樣適應南極的故事。有這個加分項，加上專注的精神，她得到職稱評審專家們的認可，在“非升即離”期限到來前2個月通過了副研究員的競聘答辯。 在我們這個時代，博士畢業8年的女學者，有的已經是博導，甚至是“帽子人才”。我們固然對那些才能卓著、鴻運當頭的青年才俊們贊賞有加，但是也同樣為經歷漫長的探索仍執著追求的人們由衷地喝彩！科研工作者能像愛親人一樣愛科學，為求真知而甘冒風險，這大概就是我們身為普通科研工作者最可寶貴的精神。 致謝：感謝王雅麗、高宏提供生活和工作照，以及汪紅、王雅麗、高宏對本文的閱讀和修改意見。參考文獻：1. Yali Wang錛 Xiaoxiang Liu錛 Hong Gao錛 Hong-Mei Zhang錛 An-Yuan Guo錛 Jian Xu錛 Xudong Xu錛 2019. Early stage adaptation of a mesophilic green alga to Antarctica: systematic increases in abundance of enzymes and LEA proteins. Molecular Biology and Evolution錛 msz273錛 https://doi.org/10.1093/molbev/msz2732. Xiaoxiang Liu錛 Yali Wang錛 Hong Gao錛 Xudong Xu錛 2011. Identification and characterization of genes encoding two novel LEA proteins in Antarctic and temperate strains of Chlorella vulgaris. Gene錛 482: 51-58.，